请教肝星状细胞的培养

圈老汉 2024-05-28 20:47:38

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肝星状细胞的培养，原代分离方法,仅供参考.
1.1动物准备雄性sd大鼠，体重500g左右，常规饲料喂养，正常饮水。在分离hscs前2周每天vitamina
200iu/100g体重胃管内注入。1.2.主要试剂与仪器
1.2.1试剂：collagenase
iv、pronasee、鼠型vegf、dnasei，rpmi1640培养基、胎牛血清、马血清、percoll。1.3肝星状细胞的分离与纯化
分离当日**0.2ml/100g体重、肝素150iu肌肉注射**后，严格消毒。置于无菌超净台，仰卧位固定。开腹后门静脉插管灌注。具体操作如下：取大十字切口，上至剑突，下至耻骨联合，左右至两侧腋**。皮瓣外翻，显露腹腔所有脏器。将小肠翻至鼠体左侧，可见肝门处门静脉由脾静脉和肠系膜静脉汇合而成。在双肾静脉上方游离肝下下腔静脉。肝上游离肝膈面，下压肝脏剪断镰状韧带至肝上下腔静脉。将9号输液针**门静脉，动脉夹固定，转动灌流泵。同时迅速钳夹肝上下腔静脉，剪开事先游离好的肾静脉上肝下下腔静脉，整个原位灌流过程开始。首先使用加葡萄糖1.0g/l、肝素5000iu/l的d-hank’s液200ml，水浴加热至39℃，流速为20ml/min。尽量将肝脏内淤积的红细胞冲出。然后使用酶灌注液，0.05mmol／lca2＋、0.05%collagenaseiv、0.08％pronasee、4.8g／l
hepes（ph7.4－7.6）、5％fcs-hi的d-hank’s液100ml，流速为5ml／min，消化肝脏。20分钟后使用无菌剪刀将肝组织剪下放入洁净的培养皿中，进入细胞室进行以下操作。在培养皿中去除肝包膜和gl**son鞘。将肝脏粉碎成糊状，放入0.05％collagenaseiv、0.001％dnasei和5.3%fcs-hi(v/v)的pbs中，37℃水浴摇动30分钟，使肝组织充分得到消化。将消化好的肝组织过100目钢丝筛，未能通过的肝组织用玻璃注射器针芯研磨，rpmi1640培养液冲洗。滤过的肝组织放入50mlfalcon离心管中，加rpmi1640培养液至50ml，20℃100x
g离心5分钟，去除大部分肝实质细胞。上清转入另一falcon管中350x g离心10分钟。取沉淀重悬于50mlrpmi1640培养液中，再次350x
g离心10分钟。沉淀重悬于16ml的pbs中，分两份分别加入已经铺好梯度的percoll的顶层。percoll的密度梯度分为3层：由上至下依次为20％（密度~1.012
g/ml）20ml、35％（密度~1.014 g/ml）15ml、50％（密度~1.018g/ml）10ml。铺好后4℃900x
g离心30分钟。轻轻取出，不要摇动液面，可见在20％percoll层中间有一混浊带。用16号针头**液面下此处抽吸约10ml。加rpmi1640培养液至50ml，900x
g离心10分钟，沉淀重悬于10ml左右rpmi1640＋199混合培养液中，内加入10％胎牛血清和10％马血清以及10ng／ml的vegf等。计数细胞产量并且行台盼蓝拒染试验，判断活力。1.4
细胞培养
重悬细胞计数后按1.5x106／孔接种于铺被胶原s的24孔板。10分钟后重吸细胞混悬液入新孔。3天后首次换液，以后视情况每2－3天换液一次。如需作免疫组化等分析，可将细胞接种于内有玻片的6孔板中。细胞融合达到80％－90％左右可进行传代。传代时常规使用0.125％胰酶。1.5细胞鉴定
细胞纯度鉴定在3天后细胞显现梭形形态时，使用高倍镜每孔随机选择10个视野，每个视野至少计数200个细胞。325nm波长紫外光激发细胞自发荧光。光镜、透射电子显微镜观察细胞形态。免疫组织化学方法鉴定原代hscs和传代hscs
de**in、α-sma的表达情况。 20210311

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