pcr要加入什么原料

可?乐糖 2024-12-01 18:05:02

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无明显同源性。

引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种taq dna聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的pcr反应约需酶量2.5u(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dntp的质量与浓度 dntp的质量与浓度和pcr扩增效率有密切关系，dntp粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dntp溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1m naoh或1m tr**。hcl的缓冲液将其ph调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dntp降解。在pcr反应中，dntp应为50～200umol/l，尤其是注意4种dntp的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低pcr产物的产量。dntp能与mg2+结合，使游离的mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是pcr成败与否的关键环节之一，传统的dna纯化方法通常采用sds和蛋白酶k来消化处理标本。 sds的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的**白，sds 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶k能水解消化蛋白质，特别是与dna结合的组蛋白，再用**酚与****掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或**沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于pcr反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于pcr扩增。rna模板提取一般采用**胍或蛋白酶k法，要防止rnase降解rna。
mg2+浓度 mg2+对pcr扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的pcr反应中，各种dntp浓度为200umol/l时，mg2+浓度为1.5～2.0mmol/l为宜。mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低taq dna聚合酶的活性，使反应产物减少。
pcr反应条件的选择
pcr反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于pcr原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链dna在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在taq dna 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度taq dna酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致pcr失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板dna变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或pcr产物完全变性，就会导致pcr失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响pcr特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板dna 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，g+c含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
tm值(解链温度)=4(g+c)＋2(a+t)
复性温度=tm值-(5～10℃)
在tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高pcr反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：taq dna聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/s/酶分子
70℃ 60核苷酸/s/酶分子
55℃ 24核苷酸/s/酶分子
高于90℃时， dna合成几乎不能进行。

pcr反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。pcr延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的dn**段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数循环次数决定pcr扩增程度。pcr循环次数主要取决于模板dna的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

pcr反应特点
特异性强 pcr反应的特异性决定因素为：
①引物与模板dna特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③taq dna聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及taq dna聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高 pcr产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，pcr的灵敏度可达3个rfu(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速 pcr反应用耐高温的taq dna聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在dna扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，dna 粗制品及总rna均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的dna扩增检测。 pcr扩增产物分析
pcr产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。pcr产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
凝胶电泳分析：pcr产物电泳，eb溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。pcr产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重pcr，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳：通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。
聚**凝胶电泳：6～10%聚**凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
酶切分析：根据pcr产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
分子杂交：分子杂交是检测pcr产物特异性的有力证据，也是检测pcr 产物碱基突变的有效方法。
southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与pcr产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测pcr产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
斑点杂交：将pcr产物点在**纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于pcr产物特异性鉴定及变异分析。
核酸序列分析：是检测pcr产物特异性的最可 20210311

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