实验操作注意事项:尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、**和扩增的所有环节都应该注意:
1、戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套。
2、使用一次性吸头,严禁与pcr产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染。
3、避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。
4、操作多份样品时,制备反应混合液,先将dntp、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度。
cr由变性→退火→延伸三个基本反应构成:
1、模板dna的变性:模板dna经加热至93℃左右一定时间后,使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备。
2、模板dna与引物的退火(复性):模板dna经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板dna单链的互补序列配对结合。
3、引物的延伸:dna模板--引物结合物在72℃、dna聚合酶(如taqdna聚合酶)的作用下,以dntp为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板dna链互补的半保留复制链。
参考资料来源:百科——聚合酶链式反应
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