这是所谓的定点突变问题。有两种常见方法,通俗说法是搭桥和p圈。
搭桥法
如图,蓝条表示基因全长,红**表示突变位点。设计如图所示的两对引物,primer1和4是基因首尾两端引物,primer2和3有部分重叠(约10多个bp),均引入突变位点。用primer1/2和primer3/4分别pcr得到前后两段的基因片段(由于引物中引入突变,两端产物实际上均是突变后的基因)。然后以这两段pcr产物混合物为模板,primer1/4为引物pcr,即可得到全长的突变基因。
p圈
首先将基因全长连在载体上构成质粒,然后以质粒为模板,用上图中的primer2/3为引物对整个质粒进行扩增。扩增产物主要是突变的基因(pcr产生的新质粒),但同时含有少量没突变的基因(作为模板的质粒)。因为质粒扩增时在eco.li中会有甲基化修饰,所以用dpni酶对pcr产物进行消化就可以破坏模板质粒。消化后的产物转化eco.li扩增就可以得到只含突变基因的质粒。
为了确保突变成功,上述两种方法得到的产物都应该送测序鉴定。
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