超长引物pcr

Meng Mary 2024-11-06 08:33:04
最佳回答
1.pcr反应的成功与否不与oligos的大小直接相关,主要看你的primer与模板特异性结合序列有多少个碱基对。虽然你的引物有97bp长,但和模板结合的位置可能仍旧只是20-30bp左右,计算退火温度时,只拿这20-30bp计算就可以了,你引物剩下的序列,只是为了引入信号肽和h**标签而已。(你可以想想在做引入突变位点的pcr时,第二部反应其实就相当于两个dna模板互为引物进行反应,那么每个引物都可以有上千bp长,也没有关系)。2.检查引物有没有回文序列,和连续超过6bp的单一碱基重复序列,检查两条引物是否互补。如果都没有,就可以了。3.问题在于,定制97bp的引物,每个碱基的单价就很贵,而且需要做purify,定制起来价格比较昂贵,我不知道国内什么价格,在美国,这样一个引物大约需要150美元左右(绝对要做purify)。如果需要降低成本,只能做两次pcr,譬如说,第一次先加上信号肽,第二次pcr再加上h**标签。4.pcr反应按照普通设置即可进行。如果你引物都这么舍得肯花钱,推荐你一个非常nb的pcr kits,叫做phusion.http://www.bioke.com/blobs/finnzymes/phusionhigh-fidelitymastermix.pdf
效果惊天地,泣鬼神。 20210311
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