分子杂交技术的几种常见的杂交

分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出目的dna或rna分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：
(1)southern杂交:dn**段经电泳分离后,从凝胶中转移到**纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为dna,探针为dna或rna。(2)northern杂交:rn**段经电泳后,从凝胶中转移到**纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为rna,探针为dna或rna。根据杂交所用的方法,另外还有斑点(dot)杂交、狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交等。有3种固相支持体可用于杂交:**纤维素滤膜、尼龙膜和whatman 541滤纸。不同商标的尼龙膜需要进行不同的处理，在dna固定和杂交的过程中要严格按生产厂家的说明书来进行。whatman 541滤纸有很高的湿强度,最早用于筛选细菌菌落。该滤纸主要用于筛选一些基因文库。固定化dna的杂交条件基本与使用**纤维素滤膜时所建立的条件相同。whatman 541滤纸与**纤维素滤膜相比有一些优点:它更便宜,杂交中更耐用,干燥过程中不易变形和碎裂等。然而若变性过程不小心,杂交信号的强度会明显弱于用**纤维素滤膜时所得到的信号强度。因此,常规的细菌筛选和各种杂交时仍选用**纤维素滤膜作为固相支持体。southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的dn**段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:
(1)酶切dna,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使dna原位变性。(2)将dn**段转移到固体支持物(**纤维素滤膜或尼龙膜)上。(3)预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。(4)让探针与同源dn**段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。(5)通过显影检查目的dna所在的位置。southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素,包括目的dna在总dna中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的dna量以及探针与目的dna间的配对情况等。在最佳条件下,放射自显影曝光数天后,southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 p标记的高比活性探针的(>109 cpm/μg)互补dna。如果将10μg基因组dna转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。将dna从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:(1)毛细管转移。本方法由southern发明,故又称为southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。(2)电泳转移。将dna变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的dn**段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。(3)真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将**纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的dna,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度()的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂,并且在洗膜不严格时,其背景**细转移要高。1、材料：待检测的dna，已标记好的探针。2、设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，x-光片，杂交袋，**纤维素滤膜或尼龙膜，滤纸。3、试剂：
(1)10mg/ml 溴化乙锭（eb）。(2)50×denhardt's溶液：5g ficoll-40,5g pvp,5g bsa加水至500ml,过滤除菌后于-20℃储存。(3)1×blotto:5g脱脂奶粉，0.02%叠氮钠，储于4℃。(4)预杂交溶液:6×ssc,5×denhardt,0.5%sds,100mg/ml鲑鱼**dna,50%甲酰胺。(5)杂交溶液:预杂交溶液中加入变性探针即为杂交溶液。(6)0.2mol/l hcl。(7)0.1%sds。(8)0.4mol/l naoh。(9)变性溶液:87.75g nacl,20.0g naoh加水至1000ml。(10)中和溶液:175.5g nacl,6.7g tr**·cl,加水至1000ml。(11)**纤维素滤膜。(12)20×ssc:3mol/l nacl,0.3mol/l柠檬酸钠,用1mol/l hcl调节ph至7.0;(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×ssc:用20×ssc稀释。4、操作步骤：
(1)约50μl体积中酶切10pg-10μg的dna,然后在琼脂糖凝胶中电泳12-24小时(包括dna分子量标准物)。(2)500ml水中加入25μl 10mg/ml溴化乙锭,将凝胶放置其中染色30分钟,然后照相。(3)依次用下列溶液处理凝胶,并轻微摇动:500ml 0.2mol/l hcl 10分钟,倾去溶液(如果限制性片段>10kb,酸处理时间为20分钟)，用水清洗数次,倾去溶液;500ml变性溶液两次,每次15分钟,倾去溶液;500ml中和溶液30分钟。如果使用尼龙膜杂交，本步可以省略。(4)戴上手套,在盘中加20×ssc液,将**纤维素滤膜先用无菌水完全湿透,再用20×ssc浸泡。将**纤维素滤膜一次准确地盖在凝胶上,去除气泡。用浸过20×ssc液的3滤纸盖住滤膜,然后加上干的3滤纸和干纸巾,根据dna复杂程度转移2-12小时。当使用尼龙膜杂交时，该膜用水浸润一次即可，转移时用0.4mol/l naoh代替20×ssc。简单的印迹转移2-3小时,对于基因组印迹,一般需要较长时间的转移。(5)去除纸巾等,用蓝色圆珠笔在滤膜右上角记下转移日期,做好记号,取出滤膜,在2×ssc中洗5分钟,凉干后在80℃中烘烤2小时。注意在使用尼龙膜杂交时，只能空气干燥，不得烘烤。(6)将滤膜放入含6-10ml预杂交液的密封小塑料袋中,将预杂交液加在袋的底部,前后挤压小袋,使滤膜湿透。在一定温度下(一般为37-42℃)预杂交3-12小时，弃去预杂交液。(7)制备同位素标记探针（参见第一节），探针煮沸变性5分钟。(8)在杂交液中加入探针,混匀。如步骤（6）将混合液注入密封塑料袋中,在与预杂交相同温度下杂交6-12小时。(9)取出滤膜,依次用下列溶液处理,并轻轻摇动:在室温下,1×ssc/0.1%sds,15分钟,两次。在杂交温度下,0.25×ssc/0.1%sds,15分钟,两次。(10)空气干燥**纤维素滤膜,然后在x光片上曝光。通常曝光1-2天后可见dna谱带。对于≥108 cpm/μg从缺口平移所得探针,可很容易地从10μg哺乳dna中检测到10pg的单拷贝基因。northern杂交与southern杂交很相似。主要区别是被检测对象为rna,其电泳在变性条件下进行,以去除rna中的二级结构,保证rna完全按分子大小分离。变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。电泳后的琼脂糖凝胶用与southern转移相同的方法将rna转移到**纤维素滤膜上,然后与探针杂交。1、材料：待检测的rna及制备好的探针。2、设备：电泳仪，电泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自显影盒，x-光片，杂交袋，**纤维素膜或尼龙膜。3、试剂：
(1)20×sspe:175.3g nacl,88.2g柠檬酸钠，溶于800ml水中，用10mol/lnaoh调ph至7.4，定溶到1l。(2)其他试剂：与southern杂交试剂类似，只是所有的试剂均应用depc处理。4、操作步骤：
(1)rna经变性电泳完毕后,可立即将乙醛酰rna转移至**纤维素滤膜上。转移方法与转移dna的方法相似。(2)转移完毕后,以6×ssc溶液于室温浸泡此膜5分钟,以除去琼脂糖碎片。(3)将该杂交膜夹于两张滤纸中间,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小时。(4)用下列两种溶液之一进行预杂交，时间为1-2小时。若于42℃进行,应采用:50%甲酰胺，5×sspe，2×denhardt's试剂，0.1%sds；若于68℃进行,应采用:6×ssc，2×denhardt's试剂，0.1%sds，（注意：blotto不能用于northern杂交）。(5)在预杂交液中加入变性的放射性标记探针,如欲检测低丰度mrna,所用探针的量至少为0.1μg,其放射性比活度应大于2×108 cpm/分·μg,放在适宜的温度条件下杂交16-24小时。(6)用1×ssc、0.1%sds于室温洗膜20分钟,随后用0.2×ssc、0.1%sds于68℃洗膜3次,每次20分钟。(7)用x光片(kodak xar-2或与之相当的产品)进行放射自显影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小时。[注意]
(1)如果琼脂糖浓度高于1%，或凝胶厚度大于0.5cm，或待分析的rna大于2.5kb,需用0.05mol/lnaoh浸泡凝胶20分钟,部分水解rna并提高转移效率。浸泡后用经depc处理的水淋洗凝胶,并用20×ssc浸泡凝胶45分钟。然后再转移到滤膜上。(2)在步骤(3)的操作中，如果滤膜上含有乙醛酰rna,杂交前需用20mmol/l tr**·cl(ph8.0)于65℃洗膜,以除去rna上的乙二醛分子。(3)rna自凝胶转移至尼龙膜所用方法，与rna转移至**纤维素滤膜所用方法类似。(4)含甲醛的凝胶在rna转移前需用经depc处理的水淋洗数次,以除去甲醛。当使用尼龙膜杂交时注意，有些带正电荷的尼龙膜在碱性溶液中具有固着核酸的能力，需用7.5mmol/lnaoh溶液洗脱琼脂糖中的乙醛酰rna，同时可部分水解rna，并提高较长rna分子(>2.3kb)转移的速度和效率。此外，碱可以除去mrna分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脱的步骤。乙醛酰rna在碱性条件下转移至带正电荷尼龙膜的操作也按dna转移的方法进行，但转移缓冲液为7.5mmol/lnaoh，转移结束后(4.5-6.0小时)，尼龙膜需用2×ssc、0.1%sds淋洗片刻、于室温晾干。(5)尼龙膜的不足之处是背景较高,用rna探针时尤为严重。将滤膜长时间置于高浓度的碱性溶液中,会导致杂交背景明显升高,可通过提高预杂交和杂交步骤中有关阻断试剂的量来予以解决。(6)如用中性缓冲液进行rna转移,转移结束后,将晾干的尼龙膜夹在两张滤纸中间,80℃干烤0.5-2小时,或者254nm波长的紫外线照射尼龙膜带rna的一面。后一种方法较为繁琐,但却优先使用,因为某些批号的带正电荷的尼龙膜经此处理后,杂交信号可以增强。然而为获得最佳效果,务必确保尼龙膜不被过度照射，适度照射可促进rna上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构,而过度照射却使rna上一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面,导致杂交信号减弱。对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行**筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张**纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。1、材料：待检测的细菌平皿，已标记好的探针，**纤维素滤膜等。2、设备：恒温烤箱，恒温水浴，台式高速离心机等。3、试剂：
(1)lb固体培养基。(2)0.5mol/l naoh。(3)1mol/l tr**·cl。(4)1.5mol/l nacl。(5)0.5mol/l tr**·cl。(6)预洗液：5×ssc,0.5%sds,1mmol/l edta(ph8.0)。(7)预杂交液：50%甲酰胺，6×ssc（或6×sspe），0.05×blotto(甲酰胺可不用)。(8)其余试剂：与southern杂交相同。4、操作步骤：
1.将少数菌落转移到**纤维素滤膜上：
(1)在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张**纤维素滤膜。(2)用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pbr322)的菌落。(3)倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。(4)用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂,在3个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。(5)用parafilm膜封好主平板,倒置贮放于4℃,直至获得杂交反应的结果。(6)裂解细菌,按本段下面所述方法,使释放的dna结合于**纤维素滤膜。2.菌落的裂解及dna结合于**纤维素滤膜
(1)在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/l naoh的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,将滤膜放到小洼上,展平保鲜膜,使滤膜均匀湿润,让滤膜留于原处2-3分钟。(2)用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜,用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/l naoh重复步骤(1)。(3)吸干滤膜,将滤膜转移到新的带有1mol/l tr**·cl(ph7.4)的保鲜膜洼上。5分钟后吸干滤膜,再重复一次该步骤。(4)吸干滤膜,把它转移到有1.5mol/l nacl、0.5mol/l tr**·cl(ph7.4)的保鲜膜小洼上5分钟后吸干滤膜,转移到一张干的滤纸上,置于室温20-30分钟,使滤膜干燥。(5)将滤膜夹在两张干的滤纸之间,在真空烤箱中于80℃干烤2小时,固定dna。(6)将固定在膜上的dna与32 p标记的探针杂交。5.杂交
(1)盛有2×ssc的塑料盘同，将干烤的滤膜飘浮在液面上,彻底浸湿5分钟。(2)将滤膜转到200ml预洗液的玻璃皿中。滤膜何叠在一起,放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿,放到位于培养箱内的旋转**上。于50℃处理30分钟。在这一步及以后的所有步骤中,应缓缓摇动滤膜,防止它们粘在一起。(3)用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭... 20210311