什么是基因二代测序？

MochenDance小天 2024-06-01 04:18:38

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第二代测序为高通量测序，采用微珠或高密度芯片边合成边测序，代表有454，solexa，solid，高通量，可一次获得数g数据，相对与第三代，都仍然需要扩增的方法放大信号，扩增后再检测。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（sequencing by synthes**），即通过捕捉新合成的末端的标记来确定dna的序列，现有的技术**主要包括roche/454 flx、illumina/solexa genome analyzer和applied biosystems solid system。第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以roche公司的454技术、illumina公司的solexa，h**eq技术和abi公司的solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。拓展资料：
1）测序文库的构建（library construction）
首先准备基因组（虽然测序公司要求样品量要达到200ng，但是gnome analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中），然后将dna随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头（adaptor）。如果是转录组测序，则文库的构建要相对麻烦些，rn**段化之后需反转成cdna，然后加上接头，或者先将rna反转成cdna，然后再片段化并加上接头。片段的大小（insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基因组测序来说，通常会选择几种不同的insert size，以便在组装（assembly）的时候获得更多的信息。2）锚定桥接（surface attachment and bridge amplification）
solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行，flow cell又被细分成8个lane，每个lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的dna 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。3）预扩增（denaturation and complete amplification）
添加未标记的dntp 和普通taq 酶进行固相桥式pcr 扩增，单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。4）单碱基延伸测序（single base extension and sequencing）
在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dntp、dna聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dntp就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做base calling，illumina公司base calling所用的软件是illumina’s genome analyzer sequencing control software and pipeline analys** software。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加，错误率也会随之上升。5）数据分析（data analyzing）
这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分，但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果。参考资料：百科-第二代dna测序技术 20210311

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