单**抗体的制备过程

lone wolf 2024-06-27 22:48:02
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过程1)免疫胞的制备 制备单**抗体的动物用纯系 balb/c小鼠。免疫的方法取所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备,也可采用脾内直接免疫法。 2)骨髓瘤细胞的培养与筛选 在融合前,骨髓瘤细胞应经过含8-ag的培养基筛选,防止细胞发生突变恢复hgprt的活性(恢复hgprt的活性的细胞不能在含8-ag的培养基中存活)。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养,融合前24h换液一次,使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3)细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术。 4)阳性**的筛选 应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测,过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质,以及所需单**抗体的功能进行选择。常用的方法有 ria法、 el**a法和免疫荧光法等。其中el**a法最简便,ria法**确。阳性**的筛选应进行多次,均阳性时才确定为阳性**进行扩增。 5)**化 **化的目的是为了获得单一细胞系的群体。**化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的,有丢失染色体的倾向。反复**化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。**化的方法很多,而最常用的是有限稀释法。(1)显微操作法:在显微镜下取单细胞,然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂,效率低,故不常用。(2)有限稀释法:将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后,按每孔1个细胞接种在培养皿中,细胞增值后成为单**细胞系。第一次**化时加一定量的饲养细胞。由于第一次**化生长的细胞不能保证单**化,所以为获得稳定的单**细胞株需经2~3次的再**才成。应该注意的是,每次**化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存,以便重复检查,避免丢失有意义的细胞。(3)软琼脂法:将杂交瘤细胞稀释到一定密度,然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动,彼此互不相混,从而达到单细胞培养的目的。但此法不如有限稀释法好。(4)荧光激光细胞分类法:用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞,然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞,并进行单细胞培养。6)细胞的冻存与复苏7)大规模单**抗体的制备 选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备,因为融合细胞随培养时间延长,发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法,即将杂交瘤细胞在体外培养,在培养液中分离单**抗体。该法需用特殊的仪器设备,一般应用无血清培养基,以利于单**抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用balb/c小鼠或其亲代小鼠,先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射,一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生,每只小鼠可收集5~10ml的腹水,有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高,每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外,腹水中的杂蛋白也较少,便于抗体的纯化。 20210311
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