蛋白质的纯化方法有那些呢?具体步骤是什么?

隔壁_老王 2024-06-24 19:42:54
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蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:

(一)材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有:

1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法

生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法

使用超声波**使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的**

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。**所用缓冲液的ph、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的**,**缓冲液中一般要加入表面活性剂(**基**、tritonx-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在**过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。

(三)蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法:

1. 等电点沉淀法

不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法

不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。

3. **沉淀法

中性**如乙醇、**,它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。此外,**会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于**会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的**浓度。

(四)样品的进一步分离纯化

用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质,须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有:凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。 20210311
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